Anti
Oksidan
Antioksidan didefinisikan sebagai
senyawa yang dapat menunda, memperlambat, dan mencegah proses oksidasi lipid.
Dalam arti khusus, antioksidan adalah zat yang dapat menunda atau mencegah
terjadinya reaksi antioksidasi radikal bebas dalam oksidasi lipid (Kochhar dan
Rossell, 1990).
Sumber-sumber antioksidan dapat
dikelompokkan menjadi dua kelompok, yaitu antioksidan sintetik (antioksidan
yang diperoleh dari hasil sintesa reaksi kimia) dan antioksidan alami
(antioksidan hasil ekstraksi bahan alami).
Beberapa
contoh antioksidan sintetik yang diijinkan penggunaanya untuk makanan dan
penggunaannya telah sering digunakan, yaitu butil hidroksi anisol (BHA), butil
hidroksi toluen (BHT), propil galat, tert-butil hidoksi quinon (TBHQ) dan
tokoferol. Antioksidan-antioksidan tersebut merupakan antioksidan alami yang
telah diproduksi secara sintetis untuk tujuan komersial.
Antioksidan alami di dalam makanan dapat
berasal dari (a) senyawa antioksidan yang sudah ada dari satu atau dua komponen
makanan, (b) senyawa antioksidan yang terbentuk dari reaksi-reaksi selama
proses pengolahan, (c) senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami dan
ditambahkan ke makanan sebagai bahan tambahan pangan (Pratt, 1992).
Senyawa antioksidan yang diisolasi dari
sumber alami adalah yang berasal dari tumbuhan. Kingdom tumbuhan, Angiosperm memiliki
kira-kira 250.000 sampai 300.000 spesies dan dari jumlah ini kurang lebih 400
spesies yang telah dikenal dapat menjadi bahan pangan manusia. Isolasi
antioksidan alami telah dilakukan dari tumbuhan yang dapat dimakan, tetapi
tidak selalu dari bagian yang dapat dimakan. Antioksidan alami tersebar di
beberapa bagian tanaman, seperti pada kayu, kulit kayu, akar, daun, buah,
bunga, biji dan serbuk sari (Pratt,1992).
Senyawa antioksidan alami tumbuhan
umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang dapat berupa golongan
flavonoid, turunan asam sinamat, kumarin, tokoferol dan asam-asam organik
polifungsional. Golongan flavonoid yang memiliki aktivitas antioksidan meliputi
flavon, flavonol, isoflavon, kateksin, flavonol dan kalkon. Sementara turunan
asam sinamat meliputi asam kafeat, asam ferulat, asam klorogenat, dan
lain-lain.
Jahe
(Zingiber officinale Roscoe) biasa digunakan sebagai bumbu atau obat
tradisional. Komponen-komponen pedas dari jahe seperti 6 gingerol dan
6-shogaol dikenal memiliki aktivitas antioksidan yang cukup. Dari ekstrak jahe
yang telah dibuang komponen volatilnya dengan destilasi uap, maka dari fraksi
non volatilnya setelah pemurnian, ditemukan adanya empat senyawa turunan
gingerol dan empat macam diarilheptanoid yang memiliki aktivitas antioksidan
kuat (Nakatani,1992).
Ada beberapa senyawa fenolik yang
memiliki aktivitas antioksidan telah berhasil diisolasi dari kedelai (Glycine
max L.), salah satunya adalah flavonoid. Flavonoid kedelai adalah unik dimana
dari semua flavonoid yang terisolasi dan teridentifikasi adalah isoflavon.
Mekanisme
kerja antioksidan
Mekanisme kerja antioksidan memiliki dua
fungsi. Fungsi pertama merupakan fungsi utama dari antioksidan yaitu sebagai
pemberi atom hidrogen. Antioksidan (AH) yang mempunyai fungsi utama tersebut
sering disebut sebagai antioksidan primer. Senyawa ini dapat memberikan atom
hidrogen secara cepat ke radikal lipida (R*, ROO*) atau mengubahnya ke bentuk
lebih stabil, sementara turunan radikal antioksidan (A*) tersebut memiliki
keadaan lebih stabil dibanding radikal lipida.
Fungsi
kedua merupakan fungsi sekunder antioksidan, yaitu memperlambat laju
autooksidasi dengan berbagai mekanisme diluar mekanisme pemutusan rantai
autooksidasi dengan pengubahan radikal lipida ke bentuk lebih stabil
(Gordon,1990).
Penambahan antioksidan (AH) primer dengan konsentrasi rendah pada lipida dapat menghambat atau mencegah reaksi autooksidasi lemak dan minyak. Penambahan tersebut dapat menghalangi reaksi oksidasi pada tahap inisiasi maupun propagasi (Gambar 1). Radikal-radikal antioksidan (A*) yang terbentuk pada reaksi tersebut relatif stabil dan tidak mempunyai cukup energi untuk dapat bereaksi dengan molekul lipida lain membentuk radikal lipida baru (Gordon, 1990).
Inisiasi :
R* + AH ———-> RH
+ A*
Radikal lipida
Radikal lipida
Propagasi
: ROO* + AH ——->
ROOH + A*
Gambar
1. Reaksi Penghambatan antioksidan primer terhadap radikal lipida (Gordon 1990)
Besar
konsentrasi antioksidan yang ditambahkan dapat berpengaruh pada laju oksidasi.
Pada konsentrasi tinggi, aktivitas antioksidan grup fenolik sering lenyap
bahkan antioksidan tersebut menjadi prooksidan (Gambar 2). Pengaruh
jumlah konsentrasi pada laju oksidasi tergantung pada struktur antioksidan,
kondisi dan sampel yang akan diuji.
AH + O2 ———–> A* + HOO*
AH + O2 ———–> A* + HOO*
AH
+ ROOH ———> RO* + H2O
+ A*
Gambar
2. Antioksidan bertindak sebagai prooksidan pada konsentrasi tinggi (Gordon
1990)
Peranan
antioksidan pada kesehatan
Proses
penuaan dan penyakit degeneratif seperti kanker kardiovaskuler, penyumbatan
pembuluh darah yang meliputi hiperlipidemik, aterosklerosis, stroke, dan
tekanan darah tinggi serta terganggunya sistem imun tubuh dapat disebabkan oleh
stress oksidatif.
Stress
oksidatif adalah keadaan tidak seimbangnya jumlah oksidan dan prooksidan dalam
tubuh. Pada kondisi ini, aktivitas molekul radikal bebas ataureactive oxygen
species (ROS) dapat menimbulkan kerusakan seluler dan genetika.
Kekurangan zat gizi dan adanya senyawa xenobiotik dari makanan atau lingkungan
yang terpolusi akan memperparah keadaan tersebut.
Bila
umumnya masyarakat Jepang atau beberapa masyarakat Asia jarang mempunyai
masalah dengan berbagai penyakit degeneratif, hal ini disebabkan oleh menu
sehat tradisionalnya yang kaya zat gizi dan komponen bioaktif. Zat-zat ini
mempunyai kemampuan sebagai antioksidan, yang berperan penting dalam menghambat
reaksi kimia oksidasi, yang dapat merusak makromolekul dan dapat menimbulkan
berbagai masalah kesehatan.
Antioksidan
vs kardiovaskular dan kanker
Peran
positif antioksidan terhadap penyakit kanker dan kardiovaskuler (terutama yang
diakibatkan oleh aterosklerosis/penyumbatan dan penyempitan pembuluh darah)
juga banyak diteliti. Antioksidan berperan dalam melindungi lipoprotein
densitas rendah (LDL) dan sangat rendah (VLDL) dari reaksi oksidasi.
Pencegahan
aterosklerosis ini dapat dilakukan dengan menghambat oksidasi LDL menggunakan
antioksidan yang banyak ditemukan pada bahan pangan.
Adapun
untuk kanker dan tumor banyak ilmuwan spesialis setuju bahwa penyakit ini
berawal dari mutasi gen atau DNA sel. Perubahan pada mutasi gen dapat terjadi
melalui mekanisme kesalahan replikasi dan kesalahan genetika yang berkisar
antara 10-15 %, atau faktor dari luar yang merubah struktur DNA seperti virus,
polusi, radiasi, dan senyawa xenobiotik dari konsumsi pangan sebesar 80-85 %.
Radikal bebas dan reaksi oksidasi berantai yang dihasilkan jelas berperan pada
proses mutasi ini. Dan resiko ini sebenarnya dapat dikurangi dengan
mengkonsumsi antioksidan dalam jumlah yang cukup.
Penutup
Hasil
oksidasi lemak pada makanan ternyata mempunyai dampak besar terhadap kesehatan
manusia yang mengkonsumsinya. Pengetahuan bagaimana cara pencegahan proses
oksidasi ini sangat diperlukan, yang pada gilirannya sangat bermanfaat pada
pemeliharaan kesehatan setiap individu. Pengetahuan berbagai jenis antioksidan
yang ada di alam serta manfaatnya bagi kesehatan tubuh sangat membantu kita
dalam mengatur pola makan untuk mendapatkan tubuh sehat dan bugar.
Berbagai
kajian dan studi tentang antioksidan masih perlu dilakukan mengingat manfaatnya
yang besar bagi kesehatan. Bahan-bahan alam dari laut seperti tumbuhan mikro
alga dan hewan laut perlu di eksplorasi karena kandungan bioaktifnya terutama
antioksidan belum secara tuntas dieksplorasi.
Uji In Vitro dan In
ViVo
A. Metode
In Vitro
Metode
In Vitro merupakan metode yang tida dilakukan dalam metabolisme di dalam tubuh
dan diukur engan instrumen tertentu. Adapun beberapa metodenya sebagai berikut
1. Uji
DPPH
Uji aktivitas antioksidan secara
kualitatif dilakukan menggunakan metoda menurut Oke dan Hamburger. Satu mg
ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 10 ml metanol.
Ekstrak metanol tersebut ditotolkan pada plat kromatografi lapis tipis (KLT)
silika gel dengan jarak 10 mm dari batas bawah dan dikeringkan. Fase gerak KLT
adalah campuran etil asetat, asam formiat, dan air perbandingan 85:15:10.
Selanjutnya dilakukan pengembangan dalam bejana kromatografi dan bercak yang
terbentuk diperiksa menggunakan semprotan pereaksi 1,1-
difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) (kosentrasi 10 mg dalam 10 ml metanol). Setelah
kering bercak yang terbentuk diperiksa di bawah lampu UV pada panjang gelombang
366 nm dan 254 nm. Bercak hasil berwarna kuning, atau biru, atau ungu muda,
menunjukkan positif adanya antioksidan. Perbedaan warna yang tampak adalah
berdasarkan konsentrasi kompleks yang terbentuk antara antioksidan dengan
pereaksi DPPH.
Uji kuantitatif aktivitas antioksidan
metode DPPH. Uji aktivitas antioksidan secara kuantitatif dilakukan menggunakan
metoda menurut Chow et al. Satu ml DPPH ditambah metanol hingga menjadi 5
ml (blanko). Sampel ekstrak dibuat dengan 3 seri konsentrasi yaitu 0, 5, 10,
dan 25 ppm. Tiap sampel ditakar dengan volume yang sama, ditambahkan 1 ml DPPH
lalu diencerkan dengan metanol hingga volumenya menjadi 5 ml. Diinkubasi pada
suhu 37°C selama 30 menit. Uji serapan dilakukan pada panjang gelombang 515 nm.
Persentase hambatan (%I) dihitung berdasarkan {(serapan blanko-serapan
sampel)/serapan blanko} x 100%. Nilai hambatan dan konsentrasi ekstrak diplot
masing-masing pada sumbu x dan y, dan persamaan garis yang diperoleh digunakan
untuk menghitung Inhibition Concentration 50% (IC50).
2. Nitrat Oksida
Dalam larutan berair pada pH fisiologis,
natrium nitroprusside menghasilkan oksida nitrat, yang berinteraksi dengan
oksigen untuk menghasilkan ion nitrit, yang dapat diukur dengan reaksi
Griess. 1 ml 10 mM natrium nitroprusside dicampur dengan 1 ml larutan uji
konsentrasi yang berbeda (80, 160, 320, 500, 800, 1000 mg / ml) dalam buffer
fosfat (pH 7,4) dan campuran diinkubasi pada 25 ° C selama 150 min. Dari campuran
diinkubasi, dicampurkan 1 ml reagen Griess '(1% sulphanilamide, 2% o-asam
fosfat 0,1% etilen diamin dihidroklorida naftil) ke dalamnya. Absorbansi
kromofor dibentuk oleh diazotization nitrit dengan sulfanilamide berikutnya
kopling dengan etilen diamin dihidroklorida naftil dibaca pada 546 nm
persentase penghambatan dihitung dengan membandingkan hasil tes dengan dari
kontrol menggunakan Persamaan. (1).
3. Aktivitas
scavenging radikal Hidroksil
Kapasitas mengais-ngais radikal
hidroksil diukur sesuai dengan metode modifikasi dari Halliwell et al. Sammpel
dari EDTA (1mM), FeCl3 (10mm), asam askorbat (1mM), H2O2 (10mm), deoksiribosa
(10mm), disiapkan dalam air deionisasi suling.
Uji ini dilakukan dengan menambahkan 0,1
ml EDTA, 0,01 ml FeCl3, 0,1 ml H2O2, 0,36 ml deoksiribosa, 1,0 ml ekstrak
konsentrasi yang berbeda (200, 400. 800, 1000, 1200 mg / ml) dilarutkan dalam
air suling , 0,33 ml buffer fosfat (50 mM, PH-7.4), 0,1 ml asam askorbat secara
berurutan. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 1 jam.
1.0 ml dari campuran diinkubasi dicampur dengan 1,0 ml 10% TCA 1,0 ml 0,5% TBA
(dalam 0,025 M NaOH yang mengandung 0,025% BHA) untuk mengembangkan pewarnaan
merah muda diukur pada 532 nm. The hidroksil aktivitas scavenging radikal dari
ekstrak dilaporkan sebagai penghambatan% degradasi deoksiribosa dihitung dengan
menggunakan Persamaan. (1).
4. Superoksida aktivitas scavenging radikal
Anion superoksida aktivitas scavenging
diukur menurut metode Robak dan Gryglewski [7] dengan beberapa modifikasi.
Semua solusi yang disiapkan dalam 100 mM buffer fosfat (pH 7,4). 1ml nitroblue
tetrazolium (NBT, 156 M), 1 ml berkurang dinukleotida nicotinamide adenin
(NADH, M 468) 3 ml larutan HEPD konsentrasi yang berbeda (50, 100, 200, 400,
800, 1000 1200 ug / ml) dicampur. Reaksi dimulai dengan menambahkan 100 ml
phenazine methosulphate (PMS, 60 M). Campuran reaksi diinkubasi pada 25 ° C
selama 5 menit, diikuti dengan pengukuran absorbansi pada 560 nm. Persentase
penghambatan dihitung dengan menggunakan Persamaan. (1).
5. kemampuan
reduktif
Daya mengurangi dari sampel uji
ditentukan atas dasar kemampuan antioksidan prinsip mereka untuk membentuk
kompleks berwarna dengan kalium ferricyanide, TCA FeCl3 itu diukur dengan
metode yang dilaporkan oleh jayprakash et al. 1 ml konsentrasi yang
berbeda (25, 50, 100, 200, 400 mg / ml) dari fraksi ekstrak dicampur dengan
kalium ferricyanide (2,5 ml, 1%) 2,5 ml buffer fosfat (pH 6,6). Campuran
diinkubasi pada suhu 50 ° C selama 20 menit. 2,5 ml TCA (10%) telah ditambahkan
ke dalamnya dan disentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit. 2,5 ml supernatan
dibawa keluar untuk ini absorbansi 2,5 ml air 0,5 ml FeCl3 (0,1%) ditambahkan
diukur pada 700 nm. Absorbansi lebih tinggi dari campuran reaksi
mengindikasikan daya mengurangi tinggi ..
B. Dalam
studi antioksidan in vivo
1. Persiapan
Senyawa Uji
Larutan stok dibuat dengan melarutkan
0,36 gram dari HEPD dalam 4,8 ml air suling. 0,4 ml larutan stok per 100 gram
tikus diberikan secara oral sehingga dosis akan menjadi 300 mg / kg berat
badan.
2. Preparasi
Hewan
Jantan galur Wistar albino (120g ± 20)
yang digunakan untuk penelitian ini. Mereka dipertahankan pada kondisi
laboratorium standar makan dengan pakan komersial diet (Hindustan Lever,
Kolkata, India) secara ad libitum. Percobaan dilakukan berdasarkan pedoman
etika hewan Kelembagaan Hewan Komite Etika.
3. Desain
Eksperimental
Setelah tujuh hari aklimatisasi, tikus
dibagi menjadi empat kelompok (n = 6). Pengobatan dilakukan selama 8 hari
sebagai berikut:
Kelompok I: kontrol normal (0,9% yang
normal saline, 1 ml / kg ip)
Kelompok II: CCl4 kontrol (CCl4: parafin
cair (1:2); ip 1ml/kg)
Kelompok III: CCl4 + HEPD (300 mg / kg /
hari, P. O'Neil).
Kelompok IV: CCl4 + obat standar
Silymarin (25 mg / kg / hari, po).
Kelompok II-IV menerima CCl4 dalam
parafin cair (1:2) (1,0 ml / kg ip) sekali dalam setiap 72 jam.
Setelah 24 jam dosis terakhir, darah
dikumpulkan dari retro-orbital pleksus bawah anestesi eter. Sampel darah
diizinkan untuk membeku dan serum dipisahkan dengan sentrifugasi pada 2500 g
pada 37 ° C dan digunakan untuk estimasi biokimia. Semua binatang kemudian
dikorbankan dan jaringan hati dikumpulkan untuk evaluasi dalam antioksidan vivo
dan penelitian lain.
4. Estimasi
parameter biokimia
Serum dianalisis untuk berbagai
parameter biokimia seperti serum glutamat oksaloasetat (SGOT), serum glutamic
piruvat transaminase (SGPT) kegiatan, dan alkali fosfatase.
Konsentrasi total protein dan bilirubin total juga diukur dengan metode Lowry
et al. dan Mallay dan Evelyn [14], masing-masing. Semua analisis dilakukan
dengan menggunakan kit yang tersedia secara komersial dari Span Diagnostics Ltd
5. Estimasi
peroksidasi lipid (PUT), enzimatik (CAT, SOD) non-enzymic (GSH) sistem
antioksidan
Persiapan sampel jaringan untuk PUT, GSH
SOD assay: 1 g jaringan hati dikumpulkan dari masing-masing tikus percobaan,
dicuci dalam garam normal dan direndam dalam kertas saring. Jaringan kemudian
dihomogenisasi dalam 10 ml 0,15 M tris penyangga (pH-7.4) dan disentrifugasi
pada 3000 g pada 4 ° C selama 30 menit. Supernatan dikumpulkan diambil untuk
peroksidasi lipid, glutathione superoksida dismutase assay.
Persiapan sampel jaringan untuk
pengujian katalase: 900 mg jaringan hati dikumpulkan dari masing-masing tikus
percobaan, dicuci normal saline direndam dalam kertas saring. Jaringan kemudian
dihomogenisasi dalam 3,0 ml buffer fosfat M/150 (pH-7.0) dan disentrifugasi
pada 3000 g pada suhu 4 ° C selama 1 jam. Supernatan dikumpulkan diambil untuk
pengujian tersebut.
6. Peroksidasi
lipid
Peroksidasi lipid (PUT) diuji sesuai
dengan metode Okhawa et al. Untuk 1ml homogenat jaringan, 1ml saline
normal (0,9% b / v) dan 2,0 ml 10% TCA ditambahkan dan dicampur dengan baik.
Campuran (3000 g) kemudian disentrifugasi pada suhu kamar selama 10 menit untuk
memisahkan protein. 2 ml supernatan diambil, 0.5ml 1,0% TBA telah ditambahkan
ke dalamnya diikuti dengan pemanasan pada 95 ° C selama 60 menit. untuk
menghasilkan warna merah muda MDA. OD dari sampel diukur pada 532 nm
menggunakan spektrofotometer Beckman DU 64. Tingkat peroksida lipid dinyatakan
sebagai nM MDA / mg tisu basah menggunakan kepunahan co-efisien 1,56 x105 M-1
cm-1.
7. Superoksida
dismutase (SOD) uji aktivitas
Superoksida dismutase (SOD) aktivitas
diuji sesuai dengan metode Marklund dan Marklund. Para homogenat hati disiapkan
dalam Tris (etilendiamin asam tetraacetic) penyangga disentrifugasi selama 40
menit pada 10000 rpm pada 4 ° C, supernatan digunakan untuk assay enzim. 2,8 ml
Tris-EDTA (terdiri dari 49,78 mM Tris 0,0012 mM EDTA, pH 8,5) 100μl Pyrogallol
(2mm) diambil dalam kuvet dipindai selama 3 menit pada 420 nm panjang
gelombang. Kemudian 2,8 ml Tris-EDTA (pH -8,5), 100μl Pyrogallol, 50μl
homogenat jaringan diambil dan dipindai selama 3 menit pada panjang gelombang
yang sama. Satu unit aktivitas SOD adalah jumlah enzim yang menghambat laju
oksidasi auto pirogalol sebesar 50% dan dinyatakan sebagai Unit / protein /
menit mg. Unit enzim dapat dihitung dengan menggunakan persamaan berikut:
Tingkat (R) = (OD akhir-awal OD) / 3
menit (4)
% Inhibisi = {(kosong OD-R) / kurus OD}
x 100 (5)
Unit enzim (U) = (% dari inhibition/50)
x faktor pengenceran umum. (6)
[50% penghambatan = 1 U]
8. Katalase
(CAT)
Aktifitas katalase diukur berdasarkan
kemampuan enzim untuk memecah H2O2. 10 sampel ml diambil dalam tabung berisi
3.0ml dari H2O2 dalam buffer fosfat (M/15 buffer fosfat, pH-7.0). Waktu yang
dibutuhkan untuk perubahan densitas 0,05 optik diamati pada 240nm terhadap
kosong yang mengandung sumber enzim dalam H2O2 penyangga fosfat bebas (0.16ml
H2O2 30% b / v terdilusi menjadi 100 ml buffer fosfat). Absorbansi tercatat
sebesar 240nm setelah penambahan enzim, At tercatat sampai OD adalah 0,45. Jika
At lebih lama dari 60 detik, prosedur diulang dengan lebih terkonsentrasi
sampel enzim. Membaca diambil pada setiap interval 3 detik [17]. Sebuah unit
katalase aktivitas jumlah enzim yang membebaskan setengah oksigen peroksida
H2O2 dari larutan konsentrasi apapun dalam 100 detik pada 250C yang ditentukan
oleh ekspresi aktivitas CAT:
Mol
H2O2 dikonsumsi / menit (unit / mg) = 2.3/Δt x ln (E awal / akhir E) x 1.63x 10(7)
dengan E = densitas optik pada 240nm,
Δ t = waktu yang dibutuhkan untuk
penurunan absorbansi.
9. Glutation tereduksi (GSH)
Glutation tereduksi (GSH) aktivitas
diuji sesuai dengan metode Ellman. Reduced Glutathione diperkirakan
spektrofotometri dengan penentuan DTNB (Dithiobis-(asam 2-nitrobenzoic))
dikurangi dengan SH-kelompok, yang dinyatakan sebagai mg / mg tisu basah.
Untuk 0,1 ml sampel jaringan yang
berbeda, 2,4 ml 0,02 M larutan EDTA ditambahkan dan disimpan di atas es mandi
selama 10 menit. Kemudian 2 ml air suling dan 0,5 ml 50% b / v TCA ditambahkan.
Campuran ini disimpan di atas es selama 10-15 menit, kemudian disentrifugasi
pada 3000 g selama 15 menit. Untuk 1 ml supernatan, 2,0 ml buffer Tris (0,4 M)
ditambahkan. Kemudian 0,05 ml larutan DTNB (Ellman yang pereaksi, DTNB 0,01 M
dalam metanol) ditambahkan dan vortexed menyeluruh. OD dibacakan (dalam waktu
2-3 menit setelah penambahan DTNB) pada 412 nm spektrofotometer terhadap reagen
kosong. Sesuai standar yang dijalankan secara bersamaan.
0 comments:
Post a Comment