Resep Campuran Penderita Diabetes

RESEP CAMPURAN UNTUK

PENDERITA DIABETES

Diabetes atau Diabetes Mellitus (DM), dalam bahasa Yunani memiliki arti tembus atau pancuran air, dan dari bahasa latin memiliki arti rasa manis, sedang di Indonesia DM lebih dikenal dengan penyakit kencing manis, di mana kadar glukosa (gula sederhana) di dalam darah menjadi tinggi karena tubuh tidak dapat memproduksi atau mengeluarkan insulin secara cukup. Dan dari beberapa tes secara langsung, pada umumnya air seni pengidap diabetes rasanya manis karena mengandung banyak gula.

Setiap makanan yang kita santap akan diubah menjadi energi oleh tubuh. Dalam lambung dan usus, makanan diuraikan menjadi beberapa elemen dasarnya, termasuk salah satu jenis gula, yaitu glukosa. Jika terdapat gula, maka pankreas menghasilkan insulin, yang membantu mengalirkan gula ke dalam sel-sel tubuh. Kemudian, gula tersebut dapat diserap dengan baik dalam tubuh dan dibakar untuk menghasilkan energi.

Ketika seseorang menderita diabetes maka pankreas orang tersebut tidak dapat menghasilkan cukup insulinuntuk menyerap gula yang diperoleh dari makanan. Itu yang menyebabkan kadar gula dalam darah menjadi tinggi akibat timbunan gula dari makanan yang tidak dapat diserap dengan baik dan dibakar menjadi energi. Penyebab lain adalah insulin yang cacat atau tubuh tidak dapat memanfaatkan insulin dengan baik.^1-6

Adapun komposisi resep sebagai berikut¹:

Simlisia	Ramuan	Bagian Di gunakan	Jumlah diolah	Cara olah	Dosis
Tambahan	Sambiloto	Daun	1/8ggm	Direbus 3 gelas air, sampai ¾ gelas air	3x Sehari
Utama	Kumis Kucing	Daun	1/8ggm
Utama	Brotowali	Batabg	3/4gr

           

Nama Simplisia, Penulisan tata nama, masing-masing khasiat

  

I.                   Simplisa Tambahan 

SAMBILOTO

Tanaman sambiloto  mempunyai nama latin Andrographis paniculata Ness memiliki sinonim Justicia paniclata Burn; Justicia latebrosa Russ. Dengan nama daerah : Papaitan, Ki peurat atau bidara.

Khasiat dan Manfaat

Secara invitro tanaman sambiloto mempunyai khasiat antidiabetik dengan cara mempengaruhi sekresi insulin dari pulau Langerhans. Daun atau herba sambiloto digunakan pada pengobatan tradisional antara lain untuk disentri, kencing manis, demam, sakit kepala, penawar bisa ular, tonikum, penyakit kulit dan tifus.^1-5

Data Praklinik

Data persen kenaikan konsentrasi glukosa darah yang disajikan pada Gambar 1 dan 2, diperoleh dari selisih konsentrasi glukosa darah pada waktu tertentu (Ct) dengan konsentrasi glukosa darah awal, yaitu sebelum induksi diabetes dengan glukosa (Co) dibagi dengan Co, dikalikan 100%. Penyajian data dalam bentuk kurva untuk mempermudah pembandingan efek yang diberikan oleh bahan-bahan uji dan pembanding. Uji dilakukan pada tikus galus wistar. Dilihat dengan menggunakan variabel waktu. Efek hipoglisemik yang diberikan oleh ekstrak etanol dapat dilihat pada kecepatan penurunan konsentrasi glukosa darah pada menit ke-60 dan 90, walaupun konsentrasi glukosanya pada menit ke-30 dan 60 lebih besar daripada kontrol. Data ini diperkuat oleh kenyataan bahwa tolbutamid yang merupakan obat antidiabetes juga memberikan konsentrasi glukosa darah yang lebih tinggi daripada kontrol pada menit ke-30. Aktifnya ekstrak etanol ini menunjukkan bahwa aktivitas hipoglisemik diberikan oleh komponen-komponen polar dari herba sambiloto. Hal ini menunjukkan bahwa cara pemakaian tradisional yang dilakukan dengan merebus herba sambiloto dan meminum air rebusannya merupakan metode yang tepat.⁶

KUMIS KUCING

 Nama Simplisia

Kumis Kucing yang memiliki nama latin Orthosiphon aristatus B1. Tanaman kumis kucing (Orthosiphon aristatus B1) merupakan tanaman menahun yang termasuk dalam famili Laminaceae (paci-pacian). Tanaman ini berasal dari India, kemudian menyebar ke beberapa negara seperti Amerika, Filipina, Papua Nugini, Afrika, Asia Tengah, Kepulauan Pasifik, Australia dan Indonesia. Kumis kucing (Orthosiphon aristatus B1) bersinonim dengan O. grandiflorus Bold dan O. stamineus Bent. Nama lokal tanaman ini adalah remujung (Jawa), sesalaseyan dan songkot koceng (Madura) dan kumis kucing (Sunda).⁵

Alasan

Di Indonesia, kumis kucing sebagai obat tradisional, telah lama dikenal oleh masyarakat luas terutama di pedesaan. Dalam dunia pengobatan modern, simplisia daun kumis kucing telah mendapat kedudukan/perhatian yang utama untuk digunakan sebagai obat yang digolongkan fitoterapi.⁵

Uji Pra Klinik

Diabetes mellitus adalah penyakit yang umum di Malaysia dan diperkirakan akan meningkat menjadi 2,48 jutaan penderita diabetes selama 2030. Orthosiphon stamineus, Benth (O. stamineus) adalah ramuan yang tradisional digunakan di Malaysia untuk mengobati masalah ginjal, asam urat, dan diabetes mellitus. Interaksi antara obat modern dan stamineus O. masih belum diketahui. Penelitian ini dilakukan untuk menguji pengaruh pemberian 14 hari oral ekstrak metanol daun O. stamineus pada fase I dan fase hati II metabolisme obat pada enzim di STZ-diinduksi pada Sprague Dawley (SD) tikus terkena diabetes. Aminopyrine, p-nitrofenol (PNP) dan 1-kloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) digunakan sebagai substrat untuk memantau dimediasi sitokrom P450 N-demethylase, UDP-glucoronosyltransferase (UGT) dan glutathione-S-transferase (GST) aktivitas masing-masing dalam hati tikus. Dari hasil, itu menunjukkan bahwa aminopyrine N-demethylase. Kegiatan tidak terpengaruh oleh perlakuan ekstrak daun O. stamineus. Sebuah signifikan peningkatan aktivitas UGT diamati pada tikus diabetes diobati dengan 31,25 mg / kg (P <0,05), 125 mg / kg (P <0,05) dan 500 mg / kg (P <0,01) dari ekstrak metanol O. stamineus saat dibandingkan dengan kelompok kontrol mereka. Aktivitas GST dalam fraksi sitosol hati yang diperoleh dari diabetes perempuan SD tikus yang diberi dengan 500 mg / kg (P <0,01) dari ekstrak metanol O. Stamineus secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok kontrol mereka. Singkatnya, ekstrak daun metanol O. stamineus bisa meningkatkan baik UGT dan aktivitas GST dalam hati tikus diabetes.⁷

Data Klinis

Efek dari Andrographis paniculata dan stamineus Orthosiphon ekstrak pada dalam glucuronidation vitro dari 4-methylumbelliferone (4MU) oleh manusia rekombinan UGTs, UGT1A1, UGT1A3, UGT1A6, UGT1A7, UGT1A8, UGT1A10, UGT2B7 dan UGT2B15 ditentukan. The hambat potensi dampak kedua ekstrak pada aktivitas masing-masing isoform UGT diteliti menggunakan 4MU sebagai substrat.

Inkubasi terkandung UDP-glukuronat acid (UDPGA) sebagai kofaktor, MgCl2 lisat sel dari isoform masing, dan 4MU di Km jelas perkiraan atau S50 nilai setiap isoform. Akhir konsentrasi Andrographis paniculata dan Orthosiphon stamineus ekstrak yang digunakan adalah 0,025, 0,25, 2,5, 25 dan 50 mg / mL dan 0,01, 0,10, 1,0, 10 dan 50 mg / mL masing-masing. Kedua ekstrak bervariasi menghambat aktivitas sebagian besar isoform dalam Konsentrasi tergantung cara. Ekstrak Andrographis paniculata adalah inhibitor yang lebih baik dari semua isoform dipelajari (IC50 1,70 mg / mL untuk UGT1A3, 2,57 mg / mL untuk UGT1A8, 2.82 mg / mL untuk UGT2B7, 5,00 mg / mL untuk UGT1A1, 5,66 mL mg / mL untuk UGT1A6, 9,88 mg / untuk UGT1A7 dan 15,66 mg / mL untuk UGT1A10). Kedua ekstrak menunjukkan kurang dari 70% penghambatan UGT2B15, sehingga nilai IC50 adalah> 50μg/mL. Penghambatan manusia UGTs oleh ekstrak Andrographis paniculata stamineus dan Orthosiphon in vitro menunjukkan potensial untuk obat-herbal ekstrak interaksi dalam pengaturan terapeutik.⁸

II.                SIMPLISIA UTAMA

BROTOWALI

                                Nama Simplisia

Memiliki nama simplisia Tinospora Caulis Lignu (Batang brotowali) Memiliki nama simplisia Tinospora crispa (L.) Miers dan memiliki sinonim Tinospora rumphii Boerl. Selain itu memiliki nama daerah sebagai berikut:

Jawa: Antawali, Bratawali, Bugis: Tampa lorong. Makasar: Tambara ula. Sunda: Andawali.²

Alasan

Alkaloid berberin dan kolumbin, glikosida pikroretosida, zat pahit pikroretin, damar lunak dan palmitin.²

Efek farmakologi

Infus batang brotowali 5%, 7,5%, dan 10% b/v dengan pemberian parenteral dapat menurunkan kadar glukosa darah kelinci dibandingkan dengan glibenklamid. (1).  Efek toksik yang paling dominan adalah depresi sumsum syaraf pusat (2), ekstrak etanol dapat menurunkan kadar gula darah.⁹

Uji Klinis

                                Uji Klinis I

Ditemukan pada kasus menentukan efek dari Tinospora crispa pada glukosa serum dan kadar insulin pada subyek sehat dan pasien dengan sakit diabetes mellitus tipe 2. Metode. Serum dari 10 subyek sehat dan 10 peserta diabetes, yang telah berpuasa semalam, yang diperoleh setiap 30-60 menit selama 3 jam puasa lanjutan dan selama 3 jam setelah konsumsi 75 g glukosa dengan atau tanpa mengkonsumsi 125 atau 250 g kapsul bubuk Tinospora crispa kering. Glukosa dan Insulin tingkat dianalisis dan daerah di bawah kurva untuk glukosa serum dan kadar insulin dihitung. Hasil. Daerah di bawah kurva rerata glukosa serum dan kadar insulin pada peserta sehat dan diabetes tidak berbeda nyata antara dengan atau tanpa Tinospora crispa kapsul bubuk kering. Dalam peserta diabetes daerah di bawah kurva glukosa sedikit lebih rendah ketika 250 mgTinospora crispa itu dicerna, tetapi tidak mencapai signifikansi statistik (478 dan 444 mg min / ml, resp, P. = 0,57).

Kesimpulan. Itu Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsumsi Tinospora crispa tidak dapat mempengaruhi glukosa serum dan kadar insulin pada subyek sehat atau pasien dengan tipe 2 diabetes mellitus.¹⁰

Uji Klinis II

Sebuah  metode placebo ganda acak blind terkontrol dilakukan untuk menentukan kegunaan

Tinospora crispa sebagai pengobatan tambahan pada pasien dengan diabetes mellitus tipe 2 yang tidak merespon obat hipoglikemik oral dan menolak suntikan insulin. Dua puluh pasien dialokasikan untuk menerima Tinospora crispa bubuk dalam bentuk kapsul dengan dosis 1 gram tiga kali sehari selama 6 bulan. Dua puluh pasien menerima plasebo. Hasil utama adalah perubahan glukosa plasma puasa, hemoglobin glikosilasi dan insulin tingkat. Karakteristik dasar dari pasien dalam kedua kelompok tidak berbeda secara nyata. Ada tidak ada perubahan signifikan dalam glukosa plasma puasa, hemoglobin glikosilasi dan tingkat insulin antara pasien dalam kelompok dan antar kelompok. Dua pasien yang menerima Tinospora crispa menunjukkan ditandai peningkatan enzim hati yang kembali normal setelah menghentikan Tinospora crispa. Selain itu, pasiendi Tinospora crispa kelompok memiliki penurunan berat badan yang signifikan dan elevasi kolesterol saat mengambil Tinospora crispa. Hal ini menyimpulkan bahwa tidak ada bukti untuk mendukung penggunaan Tinospora crispa 3 gram per hari untuk terapi tambahan pada pasien dengan diabetes mellitus tipe 2 yang tidak menanggapi hipoglikemik oral obat. Para pasien yang menerima Tinospora crispa mungkin memiliki peningkatan risiko disfungsi hati.¹¹

Indikasi

Indikasi mellitus (kencing manis)

Kontra Indikasi

Belum diketahui

Peringatan

Belum diketahui

Efek yang tidak diinginkan

Belum diketahui

Toksisitas

Belum diketahui

Penyiapan dan dosis

Infus 5%; 7,5% dan 10% b/v diberikan peroral dengan takaran  5mL/ kg bb kelinci.

15 gram brotowali direbus dengan 600 mL air hingga tersisa 300mL, saring, minum 2 kali sehri 150mL boleh ditambah madu.

Nilai LD50 ekstrak metanol batang brotowali adalah 10,11g/ kg bb mencit.

ACUAN

1.      Acuan Sediaan Herbal. Volume kedua. Jakarta: Badan Pengawas Obat dan Makanan RI; 2011

2.      Acuan Sediaan Herbal. Volume kedua. Jakarta: Badan Pengawas Obat dan Makanan RI; 2011

3.      Acuan Sediaan Herbal. Volume keempat. Jakarta: Badan Pengawas Obat dan Makanan RI; 2011

4.      Acuan Sediaan Herbal. Volume kelima. Jakarta: Badan Pengawas Obat dan Makanan RI; 2011

5.      Acuan Sediaan Herbal. Volume keenam. Jakarta: Badan Pengawas Obat dan Makanan RI; 2011

6.      Soediro, Soetarno . 1999.  Aktivitas Hipoglisemik Ekstrak Herba Sambiloto (Andrographis paniculata Nees, Acanthaceae). JMS Vol. 4 No. 2, hal. 62 – 69.

7.      Chin Jin Han, Abas Hj Hussin, Sabariah Ismail. 2009. Effect of Orthosiphon Stamineus Leaf Extracts On Hepatic Cytochrome P450, UGT And GST Activity In STZ-Induced Diabetic Rats. JOURNAL FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE & ARTS, VOL. 1, NO. 1

8.      Sabariah, Ismail, et all. 2010. Effects of Andrographis paniculata and Orthosiphon stamineus Extracts on the Glucuronidation of 4-Methylumbelliferone in Human UGT Isoforms. MDPI: Molecules, 15

9.      Lucio, Widowati.1997. Tanaman Obat Untuk Diabetes Melitus. Cemin Dunia Kedokteran No.116

10.  Theerawut Klangjareonchai and Chulaporn Roongpisuthipong. The Effect of Tinospora crispa on Serum Glucose and Insulin Levels in Patients with Type 2 DiabetesMellitus. Hindawi Publishing Corporation Journal of Biomedicine and Biotechnology Volume 2012, Article ID 808762, 4 pagesdoi:10.1155/2012/808762

11.  Chawanya Sangsuwan, Suthipol UdompanthurakSathit Vannasaeng dan Visanu Thamlikitkul. Randomized Controlled Trial of Tinospora crispa for Additional Therapy in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus. J Med Assoc Thai 2004; 87(5): 543-6.

PENGERTIAN DAN JENIS-JENIS ANTI OKSIDAN

Anti Oksidan

Antioksidan didefinisikan sebagai senyawa yang dapat menunda, memperlambat, dan mencegah proses oksidasi lipid. Dalam arti khusus, antioksidan adalah zat yang dapat menunda atau mencegah terjadinya reaksi antioksidasi radikal bebas dalam oksidasi lipid (Kochhar dan Rossell, 1990).

Sumber-sumber antioksidan dapat dikelompokkan menjadi dua kelompok, yaitu antioksidan sintetik (antioksidan yang diperoleh dari hasil sintesa reaksi kimia) dan antioksidan alami (antioksidan hasil ekstraksi bahan alami).

Beberapa contoh antioksidan sintetik yang diijinkan penggunaanya untuk makanan dan penggunaannya telah sering digunakan, yaitu butil hidroksi anisol (BHA), butil hidroksi toluen (BHT), propil galat, tert-butil hidoksi quinon (TBHQ) dan tokoferol. Antioksidan-antioksidan tersebut merupakan antioksidan alami yang telah diproduksi secara sintetis untuk tujuan komersial.

Antioksidan alami di dalam makanan dapat berasal dari (a) senyawa antioksidan yang sudah ada dari satu atau dua komponen makanan, (b) senyawa antioksidan yang terbentuk dari reaksi-reaksi selama proses pengolahan, (c) senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami dan ditambahkan ke makanan sebagai bahan tambahan pangan (Pratt, 1992).

Senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami adalah yang berasal dari tumbuhan. Kingdom tumbuhan, Angiosperm memiliki kira-kira 250.000 sampai 300.000 spesies dan dari jumlah ini kurang lebih 400 spesies yang telah dikenal dapat menjadi bahan pangan manusia. Isolasi antioksidan alami telah dilakukan dari tumbuhan yang dapat dimakan, tetapi tidak selalu dari bagian yang dapat dimakan. Antioksidan alami tersebar di beberapa bagian tanaman, seperti pada kayu, kulit kayu, akar, daun, buah, bunga, biji dan serbuk sari (Pratt,1992).

Senyawa antioksidan alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang dapat berupa golongan flavonoid, turunan asam sinamat, kumarin, tokoferol dan asam-asam organik polifungsional. Golongan flavonoid yang memiliki aktivitas antioksidan meliputi flavon, flavonol, isoflavon, kateksin, flavonol dan kalkon. Sementara turunan asam sinamat meliputi asam kafeat, asam ferulat, asam klorogenat, dan lain-lain.

Jahe (Zingiber officinale Roscoe) biasa digunakan sebagai bumbu atau obat tradisional.  Komponen-komponen pedas dari jahe seperti 6 gingerol dan 6-shogaol dikenal memiliki aktivitas antioksidan yang cukup. Dari ekstrak jahe yang telah dibuang komponen volatilnya dengan destilasi uap, maka dari fraksi non volatilnya setelah pemurnian, ditemukan adanya empat senyawa turunan gingerol dan empat macam diarilheptanoid yang memiliki aktivitas antioksidan kuat (Nakatani,1992).

Ada beberapa senyawa fenolik yang memiliki aktivitas antioksidan telah berhasil diisolasi dari kedelai (Glycine max L.), salah satunya adalah flavonoid. Flavonoid kedelai adalah unik dimana dari semua flavonoid yang terisolasi dan teridentifikasi adalah isoflavon.

Mekanisme kerja antioksidan

Mekanisme kerja antioksidan memiliki dua fungsi. Fungsi pertama merupakan fungsi utama dari antioksidan yaitu sebagai pemberi atom hidrogen. Antioksidan (AH) yang mempunyai fungsi utama tersebut sering disebut sebagai antioksidan primer. Senyawa ini dapat memberikan atom hidrogen secara cepat ke radikal lipida (R*, ROO*) atau mengubahnya ke bentuk lebih stabil, sementara turunan radikal antioksidan (A*) tersebut memiliki keadaan lebih stabil dibanding radikal lipida.

Fungsi kedua merupakan fungsi sekunder antioksidan, yaitu memperlambat laju autooksidasi dengan berbagai mekanisme diluar mekanisme pemutusan rantai autooksidasi dengan pengubahan radikal lipida ke bentuk lebih stabil (Gordon,1990).

Penambahan antioksidan (AH) primer dengan konsentrasi rendah pada lipida dapat menghambat atau mencegah reaksi autooksidasi lemak dan minyak. Penambahan tersebut dapat menghalangi reaksi oksidasi pada tahap inisiasi maupun propagasi (Gambar 1).  Radikal-radikal antioksidan (A*) yang terbentuk pada reaksi tersebut relatif stabil dan tidak mempunyai cukup energi untuk dapat bereaksi dengan molekul lipida lain membentuk radikal lipida baru (Gordon, 1990).

Inisiasi      :     R*  +  AH  ———->  RH  +   A*
Radikal lipida

Propagasi  :    ROO*   +   AH  ——->  ROOH  +   A*

Gambar 1. Reaksi Penghambatan antioksidan primer terhadap radikal lipida (Gordon 1990)

Besar konsentrasi antioksidan yang ditambahkan dapat berpengaruh pada laju oksidasi. Pada konsentrasi tinggi, aktivitas antioksidan grup fenolik sering lenyap bahkan antioksidan tersebut menjadi prooksidan (Gambar 2).  Pengaruh jumlah konsentrasi pada laju oksidasi tergantung pada struktur antioksidan, kondisi dan sampel yang akan diuji.
AH   +    O2     ———–>   A*    +   HOO*

AH  +  ROOH  ———>   RO*  +   H2O  +  A*

Gambar 2. Antioksidan bertindak sebagai prooksidan pada konsentrasi tinggi (Gordon 1990)

Peranan antioksidan pada kesehatan

Proses penuaan dan penyakit degeneratif seperti kanker kardiovaskuler, penyumbatan pembuluh darah yang meliputi hiperlipidemik, aterosklerosis, stroke, dan tekanan darah tinggi serta terganggunya sistem imun tubuh dapat disebabkan oleh stress oksidatif.

Stress oksidatif adalah keadaan tidak seimbangnya jumlah oksidan dan prooksidan dalam tubuh. Pada kondisi ini, aktivitas molekul radikal bebas ataureactive oxygen species (ROS) dapat menimbulkan kerusakan seluler dan genetika. Kekurangan zat gizi dan adanya senyawa xenobiotik dari makanan atau lingkungan yang terpolusi akan memperparah keadaan tersebut.

Bila umumnya masyarakat Jepang atau beberapa masyarakat Asia jarang mempunyai masalah dengan berbagai penyakit degeneratif, hal ini disebabkan oleh menu sehat tradisionalnya yang kaya zat gizi dan komponen bioaktif. Zat-zat ini mempunyai kemampuan sebagai antioksidan, yang berperan penting dalam menghambat reaksi kimia oksidasi, yang dapat merusak makromolekul dan dapat menimbulkan berbagai masalah kesehatan.

Antioksidan vs kardiovaskular dan kanker

Peran positif antioksidan terhadap penyakit kanker dan kardiovaskuler (terutama yang diakibatkan oleh aterosklerosis/penyumbatan dan penyempitan pembuluh darah) juga banyak diteliti. Antioksidan berperan dalam melindungi lipoprotein densitas rendah (LDL) dan sangat rendah (VLDL) dari reaksi oksidasi.

Pencegahan aterosklerosis ini dapat dilakukan dengan menghambat oksidasi LDL menggunakan antioksidan yang banyak ditemukan pada bahan pangan.

Adapun untuk kanker dan tumor banyak ilmuwan spesialis setuju bahwa penyakit ini berawal dari mutasi gen atau DNA sel. Perubahan pada mutasi gen dapat terjadi melalui mekanisme kesalahan replikasi dan kesalahan genetika yang berkisar antara 10-15 %, atau faktor dari luar yang merubah struktur DNA seperti virus, polusi, radiasi, dan senyawa xenobiotik dari konsumsi pangan sebesar 80-85 %. Radikal bebas dan reaksi oksidasi berantai yang dihasilkan jelas berperan pada proses mutasi ini. Dan resiko ini sebenarnya dapat dikurangi dengan mengkonsumsi antioksidan dalam jumlah yang cukup.

Penutup

Hasil oksidasi lemak pada makanan ternyata mempunyai dampak besar terhadap kesehatan manusia yang mengkonsumsinya. Pengetahuan bagaimana cara pencegahan proses oksidasi ini sangat diperlukan, yang pada gilirannya sangat bermanfaat pada pemeliharaan kesehatan setiap individu. Pengetahuan berbagai jenis antioksidan yang ada di alam serta manfaatnya bagi kesehatan tubuh sangat membantu kita dalam mengatur pola makan untuk mendapatkan tubuh sehat dan bugar.

Berbagai kajian dan studi tentang antioksidan masih perlu dilakukan mengingat manfaatnya yang besar bagi kesehatan. Bahan-bahan alam dari laut seperti tumbuhan mikro alga dan hewan laut perlu di eksplorasi karena kandungan bioaktifnya terutama antioksidan belum secara tuntas dieksplorasi.

Uji In Vitro dan In ViVo

    A.  Metode In Vitro

Metode In Vitro merupakan metode yang tida dilakukan dalam metabolisme di dalam tubuh dan diukur engan instrumen tertentu. Adapun beberapa metodenya sebagai berikut

     1.    Uji DPPH

Uji aktivitas antioksidan secara kualitatif dilakukan menggunakan metoda menurut Oke dan Hamburger. Satu mg ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 10 ml metanol. Ekstrak metanol tersebut ditotolkan pada plat kromatografi lapis tipis (KLT) silika gel dengan jarak 10 mm dari batas bawah dan dikeringkan. Fase gerak KLT adalah campuran etil asetat, asam formiat, dan air perbandingan 85:15:10. Selanjutnya dilakukan pengembangan dalam bejana kromatografi dan bercak yang terbentuk diperiksa menggunakan semprotan pereaksi 1,1- difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) (kosentrasi 10 mg dalam 10 ml metanol). Setelah kering bercak yang terbentuk diperiksa di bawah lampu UV pada panjang gelombang 366 nm dan 254 nm. Bercak hasil berwarna kuning, atau biru, atau ungu muda, menunjukkan positif adanya antioksidan. Perbedaan warna yang tampak adalah berdasarkan konsentrasi kompleks yang terbentuk antara antioksidan dengan pereaksi DPPH.

Uji kuantitatif aktivitas antioksidan metode DPPH. Uji aktivitas antioksidan secara kuantitatif dilakukan menggunakan metoda menurut Chow et al. Satu ml DPPH ditambah metanol hingga menjadi 5 ml (blanko). Sampel ekstrak dibuat dengan 3 seri konsentrasi yaitu 0, 5, 10, dan 25 ppm. Tiap sampel ditakar dengan volume yang sama, ditambahkan 1 ml DPPH lalu diencerkan dengan metanol hingga volumenya menjadi 5 ml. Diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Uji serapan dilakukan pada panjang gelombang 515 nm. Persentase hambatan (%I) dihitung berdasarkan {(serapan blanko-serapan sampel)/serapan blanko} x 100%. Nilai hambatan dan konsentrasi ekstrak diplot masing-masing pada sumbu x dan y, dan persamaan garis yang diperoleh digunakan untuk menghitung  Inhibition Concentration 50% (IC50).

     2.     Nitrat Oksida

Dalam larutan berair pada pH fisiologis, natrium nitroprusside menghasilkan oksida nitrat, yang berinteraksi dengan oksigen untuk menghasilkan ion nitrit, yang dapat diukur dengan reaksi Griess. 1 ml 10 mM natrium nitroprusside dicampur dengan 1 ml larutan uji konsentrasi yang berbeda (80, 160, 320, 500, 800, 1000 mg / ml) dalam buffer fosfat (pH 7,4) dan campuran diinkubasi pada 25 ° C selama 150 min. Dari campuran diinkubasi, dicampurkan 1 ml reagen Griess '(1% sulphanilamide, 2% o-asam fosfat 0,1% etilen diamin dihidroklorida naftil) ke dalamnya. Absorbansi kromofor dibentuk oleh diazotization nitrit dengan sulfanilamide berikutnya kopling dengan etilen diamin dihidroklorida naftil dibaca pada 546 nm persentase penghambatan dihitung dengan membandingkan hasil tes dengan dari kontrol menggunakan Persamaan. (1).

     3.     Aktivitas scavenging radikal Hidroksil

Kapasitas mengais-ngais radikal hidroksil diukur sesuai dengan metode modifikasi dari Halliwell et al. Sammpel dari EDTA (1mM), FeCl3 (10mm), asam askorbat (1mM), H2O2 (10mm), deoksiribosa (10mm), disiapkan dalam air deionisasi suling.

Uji ini dilakukan dengan menambahkan 0,1 ml EDTA, 0,01 ml FeCl3, 0,1 ml H2O2, 0,36 ml deoksiribosa, 1,0 ml ekstrak konsentrasi yang berbeda (200, 400. 800, 1000, 1200 mg / ml) dilarutkan dalam air suling , 0,33 ml buffer fosfat (50 mM, PH-7.4), 0,1 ml asam askorbat secara berurutan. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 1 jam. 1.0 ml dari campuran diinkubasi dicampur dengan 1,0 ml 10% TCA 1,0 ml 0,5% TBA (dalam 0,025 M NaOH yang mengandung 0,025% BHA) untuk mengembangkan pewarnaan merah muda diukur pada 532 nm. The hidroksil aktivitas scavenging radikal dari ekstrak dilaporkan sebagai penghambatan% degradasi deoksiribosa dihitung dengan menggunakan Persamaan. (1).

     4.       Superoksida aktivitas scavenging radikal

Anion superoksida aktivitas scavenging diukur menurut metode Robak dan Gryglewski [7] dengan beberapa modifikasi. Semua solusi yang disiapkan dalam 100 mM buffer fosfat (pH 7,4). 1ml nitroblue tetrazolium (NBT, 156 M), 1 ml berkurang dinukleotida nicotinamide adenin (NADH, M 468) 3 ml larutan HEPD konsentrasi yang berbeda (50, 100, 200, 400, 800, 1000 1200 ug / ml) dicampur. Reaksi dimulai dengan menambahkan 100 ml phenazine methosulphate (PMS, 60 M). Campuran reaksi diinkubasi pada 25 ° C selama 5 menit, diikuti dengan pengukuran absorbansi pada 560 nm. Persentase penghambatan dihitung dengan menggunakan Persamaan. (1).

      5.      kemampuan reduktif

Daya mengurangi dari sampel uji ditentukan atas dasar kemampuan antioksidan prinsip mereka untuk membentuk kompleks berwarna dengan kalium ferricyanide, TCA FeCl3 itu diukur dengan metode yang dilaporkan oleh jayprakash et al. 1 ml konsentrasi yang berbeda (25, 50, 100, 200, 400 mg / ml) dari fraksi ekstrak dicampur dengan kalium ferricyanide (2,5 ml, 1%) 2,5 ml buffer fosfat (pH 6,6). Campuran diinkubasi pada suhu 50 ° C selama 20 menit. 2,5 ml TCA (10%) telah ditambahkan ke dalamnya dan disentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit. 2,5 ml supernatan dibawa keluar untuk ini absorbansi 2,5 ml air 0,5 ml FeCl3 (0,1%) ditambahkan diukur pada 700 nm. Absorbansi lebih tinggi dari campuran reaksi mengindikasikan daya mengurangi tinggi ..

     B.     Dalam studi antioksidan in vivo

      1.      Persiapan Senyawa Uji

Larutan stok dibuat dengan melarutkan 0,36 gram dari HEPD dalam 4,8 ml air suling. 0,4 ml larutan stok per 100 gram tikus diberikan secara oral sehingga dosis akan menjadi 300 mg / kg berat badan.

      2.      Preparasi Hewan

Jantan galur Wistar albino (120g ± 20) yang digunakan untuk penelitian ini. Mereka dipertahankan pada kondisi laboratorium standar makan dengan pakan komersial diet (Hindustan Lever, Kolkata, India) secara ad libitum. Percobaan dilakukan berdasarkan pedoman etika hewan Kelembagaan Hewan Komite Etika.

      3.      Desain Eksperimental

Setelah tujuh hari aklimatisasi, tikus dibagi menjadi empat kelompok (n = 6). Pengobatan dilakukan selama 8 hari sebagai berikut:

Kelompok I: kontrol normal (0,9% yang normal saline, 1 ml / kg ip)

Kelompok II: CCl4 kontrol (CCl4: parafin cair (1:2); ip 1ml/kg)

Kelompok III: CCl4 + HEPD (300 mg / kg / hari, P. O'Neil).

Kelompok IV: CCl4 + obat standar Silymarin (25 mg / kg / hari, po).

Kelompok II-IV menerima CCl4 dalam parafin cair (1:2) (1,0 ml / kg ip) sekali dalam setiap 72 jam.

Setelah 24 jam dosis terakhir, darah dikumpulkan dari retro-orbital pleksus bawah anestesi eter. Sampel darah diizinkan untuk membeku dan serum dipisahkan dengan sentrifugasi pada 2500 g pada 37 ° C dan digunakan untuk estimasi biokimia. Semua binatang kemudian dikorbankan dan jaringan hati dikumpulkan untuk evaluasi dalam antioksidan vivo dan penelitian lain.

      4.      Estimasi parameter biokimia

Serum dianalisis untuk berbagai parameter biokimia seperti serum glutamat oksaloasetat (SGOT), serum glutamic piruvat transaminase (SGPT) kegiatan, dan alkali fosfatase. Konsentrasi total protein dan bilirubin total juga diukur dengan metode Lowry et al. dan Mallay dan Evelyn [14], masing-masing. Semua analisis dilakukan dengan menggunakan kit yang tersedia secara komersial dari Span Diagnostics Ltd

   5.   Estimasi peroksidasi lipid (PUT), enzimatik (CAT, SOD) non-enzymic (GSH) sistem antioksidan

Persiapan sampel jaringan untuk PUT, GSH SOD assay: 1 g jaringan hati dikumpulkan dari masing-masing tikus percobaan, dicuci dalam garam normal dan direndam dalam kertas saring. Jaringan kemudian dihomogenisasi dalam 10 ml 0,15 M tris penyangga (pH-7.4) dan disentrifugasi pada 3000 g pada 4 ° C selama 30 menit. Supernatan dikumpulkan diambil untuk peroksidasi lipid, glutathione superoksida dismutase assay.

Persiapan sampel jaringan untuk pengujian katalase: 900 mg jaringan hati dikumpulkan dari masing-masing tikus percobaan, dicuci normal saline direndam dalam kertas saring. Jaringan kemudian dihomogenisasi dalam 3,0 ml buffer fosfat M/150 (pH-7.0) dan disentrifugasi pada 3000 g pada suhu 4 ° C selama 1 jam. Supernatan dikumpulkan diambil untuk pengujian tersebut.

     6.      Peroksidasi lipid

Peroksidasi lipid (PUT) diuji sesuai dengan metode Okhawa et al. Untuk 1ml homogenat jaringan, 1ml saline normal (0,9% b / v) dan 2,0 ml 10% TCA ditambahkan dan dicampur dengan baik. Campuran (3000 g) kemudian disentrifugasi pada suhu kamar selama 10 menit untuk memisahkan protein. 2 ml supernatan diambil, 0.5ml 1,0% TBA telah ditambahkan ke dalamnya diikuti dengan pemanasan pada 95 ° C selama 60 menit. untuk menghasilkan warna merah muda MDA. OD dari sampel diukur pada 532 nm menggunakan spektrofotometer Beckman DU 64. Tingkat peroksida lipid dinyatakan sebagai nM MDA / mg tisu basah menggunakan kepunahan co-efisien 1,56 x105 M-1 cm-1.

     7.      Superoksida dismutase (SOD) uji aktivitas

Superoksida dismutase (SOD) aktivitas diuji sesuai dengan metode Marklund dan Marklund. Para homogenat hati disiapkan dalam Tris (etilendiamin asam tetraacetic) penyangga disentrifugasi selama 40 menit pada 10000 rpm pada 4 ° C, supernatan digunakan untuk assay enzim. 2,8 ml Tris-EDTA (terdiri dari 49,78 mM Tris 0,0012 mM EDTA, pH 8,5) 100μl Pyrogallol (2mm) diambil dalam kuvet dipindai selama 3 menit pada 420 nm panjang gelombang. Kemudian 2,8 ml Tris-EDTA (pH -8,5), 100μl Pyrogallol, 50μl homogenat jaringan diambil dan dipindai selama 3 menit pada panjang gelombang yang sama. Satu unit aktivitas SOD adalah jumlah enzim yang menghambat laju oksidasi auto pirogalol sebesar 50% dan dinyatakan sebagai Unit / protein / menit mg. Unit enzim dapat dihitung dengan menggunakan persamaan berikut:

Tingkat (R) = (OD akhir-awal OD) / 3 menit (4)

% Inhibisi = {(kosong OD-R) / kurus OD} x 100 (5)

Unit enzim (U) = (% dari inhibition/50) x faktor pengenceran umum. (6)

[50% penghambatan = 1 U]

      8.       Katalase (CAT)

Aktifitas katalase diukur berdasarkan kemampuan enzim untuk memecah H2O2. 10 sampel ml diambil dalam tabung berisi 3.0ml dari H2O2 dalam buffer fosfat (M/15 buffer fosfat, pH-7.0). Waktu yang dibutuhkan untuk perubahan densitas 0,05 optik diamati pada 240nm terhadap kosong yang mengandung sumber enzim dalam H2O2 penyangga fosfat bebas (0.16ml H2O2 30% b / v terdilusi menjadi 100 ml buffer fosfat). Absorbansi tercatat sebesar 240nm setelah penambahan enzim, At tercatat sampai OD adalah 0,45. Jika At lebih lama dari 60 detik, prosedur diulang dengan lebih terkonsentrasi sampel enzim. Membaca diambil pada setiap interval 3 detik [17]. Sebuah unit katalase aktivitas jumlah enzim yang membebaskan setengah oksigen peroksida H2O2 dari larutan konsentrasi apapun dalam 100 detik pada 250C yang ditentukan oleh ekspresi aktivitas CAT:

Mol H2O2 dikonsumsi / menit (unit / mg) = 2.3/Δt x ln (E awal / akhir E) x 1.63x 10(7)

dengan E = densitas optik pada 240nm,

Δ t = waktu yang dibutuhkan untuk penurunan absorbansi.

      9.       Glutation tereduksi (GSH)

Glutation tereduksi (GSH) aktivitas diuji sesuai dengan metode Ellman. Reduced Glutathione diperkirakan spektrofotometri dengan penentuan DTNB (Dithiobis-(asam 2-nitrobenzoic)) dikurangi dengan SH-kelompok, yang dinyatakan sebagai mg / mg tisu basah.

Untuk 0,1 ml sampel jaringan yang berbeda, 2,4 ml 0,02 M larutan EDTA ditambahkan dan disimpan di atas es mandi selama 10 menit. Kemudian 2 ml air suling dan 0,5 ml 50% b / v TCA ditambahkan. Campuran ini disimpan di atas es selama 10-15 menit, kemudian disentrifugasi pada 3000 g selama 15 menit. Untuk 1 ml supernatan, 2,0 ml buffer Tris (0,4 M) ditambahkan. Kemudian 0,05 ml larutan DTNB (Ellman yang pereaksi, DTNB 0,01 M dalam metanol) ditambahkan dan vortexed menyeluruh. OD dibacakan (dalam waktu 2-3 menit setelah penambahan DTNB) pada 412 nm spektrofotometer terhadap reagen kosong. Sesuai standar yang dijalankan secara bersamaan.